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近年來，無細胞蛋白合成已成為蛋白質制備的方法，因為它相比基于細菌和真核細胞的表達方法具有諸多優勢，比如體外系統便于對反應進行修飾和優化，并且通過允許添加多種輔助物質能夠合成難以表達的蛋白質，通過使用細胞內代謝反應的特定抑制劑，可以實現蛋白質的精確穩定同位素標記（這種標記在體內表達時不可避免地會被代謝）[1]。
而在蛋白質工程與新一代抗體偶聯藥物（ADC）的研發中，非天然氨基酸（nnAA/unAA）在蛋白特定位點實現高效、精準的插入，是拓展蛋白功能、實現定點偶聯的關鍵技術。無細胞蛋白合成（CFPS）技術憑借其“開放體系"的天然優勢，正在成為非天然氨基酸定點插入最有力的解決方案。
圖1：通過CFPS摻入多種非天然氨基酸[2]
為什么非天然氨基酸插入如此重要？
天然蛋白質由20種氨基酸構成，其側鏈化學性質相對有限，難以滿足多樣化的功能改造需求。非天然氨基酸是天然氨基酸的衍生物，帶有新型化學性質和多樣結構的側鏈基團，可在蛋白特定位點引入疊氮、炔基、鹵素、酮基等“化學手柄"，從而實現：
ADC 定點偶聯：為抗體提供特異性偶聯位點，顯著提升藥物均一性，改善藥代動力學（PK）特性，實現毒素精準遞送；
蛋白質工程與酶進化：增強催化活性、熱穩定性或光穩定性，賦予熒光標記等探測功能；
生物材料與基礎研究：制備新型蛋白材料，研究蛋白質相互作用及翻譯后修飾對功能的影響。
據文獻報道，已有超過100種非天然氨基酸被位點特異性地插入蛋白質，用于熒光探針、聚合物及藥物偶聯等多種目的[2]。
圖2：氨基酸結構
活細胞體系存在的瓶頸
既然非天然氨基酸這么好，為什么長期以來難以大規模應用？
傳統的基于活細胞的表達體系在非天然氨基酸插入中存在固有局限：
細胞膜屏障導致許多非天然氨基酸胞內攝取效率低下；
部分非天然氨基酸及正交表達元件對宿主細胞存在毒性，限制了表達產量；
胞內代謝網絡可能降解或修飾非天然氨基酸底物；
釋放因子 1（RF-1）對 UAG 密碼子的識別與正交tRNA（o-tRNA） 形成直接競爭，導致插入效率不足。這些瓶頸推動了CFPS體系在該領域的快速發展。
CFPS 體系的技術優勢
CFPS 體系通過在體外重建轉錄 - 翻譯偶聯反應，其開放性天然具備優勢：首先，非天然氨基酸可直接添加至反應體系，無需考慮跨膜運輸，濃度可精確控制。其次，由于沒有活細胞的生長壓力，CFPS不受非天然氨基酸或目標蛋白毒性的影。另外，CFPS反應體系開放，研究人員可自由優化氨酰tRNA合成酶（aaRS）/tRNA的比例，添加輔助因子。最后，相比活細胞，CFPS在多位點同時插入非天然氨基酸的效率顯著更高。
目前已有研究證明CFPS體系在非天然氨基酸插入上的應用，日本理化學研究所（RIKEN）的Jiro Adachi等人基于抽提物，實現了超過90%的UAG翻譯效率，并可在蛋白的多個位點插入不同非天然氨基酸[2]。
圖3：基于 RFzero-iy 的無細胞系統用于非天然氨基酸摻入[2]
斯坦福大學Swartz實驗室開發的正交tRNA與目標蛋白在CFPS體系中共轉錄翻譯的方法，抑制效率達50%—88%，改造蛋白產量可達0.9—1.7 mg/mL[3]。
圖4：CFPS平臺用于定點插入非天然氨基酸的示意圖[3]
此外，開放的無細胞體系還天然適合作為aaRS突變體的高通量篩選平臺，Sutro公司利用這一優勢，直接在無細胞體系中篩選出對pAMF具有高活性和高特異性的新型TyrRS突變體。
圖5：pAMF特異性TyrRS變體可產生具有高DAR值的強效ADCs[4]
產業案例
珀羅汀生物是國內在這一方向上具備扎實技術積累的團隊。公司依托自研的CFPS平臺，建立了成熟的非天然氨基酸定點插入技術路線：通過終止密碼子（UAG）擴展，搭配RS/tRNA系統，并在體系層面優化釋放因子（RF）競爭，實現非天然氨基酸的高效、準確插入。
在實際驗證中，公司平臺已完成pAzF、pAcF等多種常用非天然氨基酸的插入測試，并在綠色熒光蛋白（GFP）等模型蛋白上驗證了從單點到多位點插入的表達效率。
圖6：多位點插入效率測試
更具挑戰性的是，公司成功實現了某毒性蛋白在6個位點同時插入非天然氨基酸，質譜檢測結果進一步表明，交付蛋白中“非正確插入"的非天然氨基酸占比極少，插入特異性優異。而這類任務在活細胞體系中幾乎不可能完成。這一結果對依賴非天然氨基酸定點插入的毒性蛋白及ADC等創新藥物研發具有重要參考價值。
圖7：驗證結果。左圖為蛋白表達膠圖，右圖為質譜檢測峰圖
結語
從RFzero快速菌株構建，到協同轉錄o-tRNA平臺，再到產業化實踐，CFPS正在重塑非天然氨基酸定點插入的技術格局。對研發團隊而言，選擇一套成熟、開放、可靈活調控的無細胞天然氨基酸插入平臺，無疑將加速從“概念驗證"到“臨床候選物"的轉化進程
參考文獻：
Terada T., Kusano S., Matsuda T., Shirouzu M., Yokoyama S. Cell-Free Protein Production for Structural Biology. Adv. Methods Struct. Biol. 2016:83–102. doi: 10.1007/978-4-431-56030-2.
Adachi J, Katsura K, Seki E, et al. Cell-Free Protein Synthesis Using S30 Extracts from Escherichia coli RFzero Strains for Efficient Incorporation of Non-Natural Amino Acids into Proteins. Int J Mol Sci. 2019;20(3):492. Published 2019 Jan 24. doi:10.3390/ijms20030492.
Albayrak C, Swartz JR. Cell-free co-production of an orthogonal transfer RNA activates efficient site-specific non-natural amino acid incorporation. Nucleic Acids Res. 2013;41(11):5949-5963. doi:10.1093/nar/gkt226.
Zimmerman ES, Heibeck TH, Gill A, et al. Production of site-specific antibody-drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjug Chem. 2014;25(2):351-361. doi:10.1021/bc400490z.
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