過去很長一段時(shí)間，蛋白質(zhì)研發(fā)的核心問題是“如何獲得一個(gè)目標(biāo)蛋白"。研究人員通常圍繞一個(gè)明確的蛋白序列建立表達(dá)載體，經(jīng)過宿主轉(zhuǎn)化、細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)、裂解、純化，再通過酶活、結(jié)合、穩(wěn)定性或結(jié)構(gòu)分析判斷蛋白是否符合預(yù)期。

這套流程經(jīng)過多年發(fā)展已經(jīng)相當(dāng)成熟，但隨著蛋白質(zhì)工程、抗體發(fā)現(xiàn)和人工智能蛋白設(shè)計(jì)技術(shù)快速發(fā)展，研發(fā)范式正在發(fā)生一個(gè)非常明顯的變化：研究人員面對的已經(jīng)不再是一個(gè)或幾個(gè)候選序列，而可能是幾十、幾百甚至上千個(gè)需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的蛋白設(shè)計(jì)。

隨著AI輔助蛋白設(shè)計(jì)的發(fā)展，蛋白研發(fā)正在從少量候選物驗(yàn)證轉(zhuǎn)向更大規(guī)模的序列探索，但計(jì)算設(shè)計(jì)最終仍然必須通過實(shí)驗(yàn)判斷其真實(shí)的表達(dá)、穩(wěn)定性和功能^[1,2]。

2024年，Thornton等在 Protein Science 發(fā)表綜述指出，CFPS特別適合對幾十至數(shù)百個(gè)設(shè)計(jì)蛋白進(jìn)行并行表達(dá)和功能篩選，并且能夠幫助研究人員區(qū)分轉(zhuǎn)錄、翻譯、溶解性以及最終結(jié)構(gòu)與功能等不同層面的失敗原因^[1]。

要理解CFPS為什么適合高通量篩選，首先需要重新審視傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)模式所面臨的問題。

在大腸桿菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白，本質(zhì)上是把目標(biāo)蛋白的生產(chǎn)過程放進(jìn)一個(gè)復(fù)雜的生命系統(tǒng)里。研究人員還需要考慮細(xì)胞生長狀態(tài)、培養(yǎng)條件、誘導(dǎo)時(shí)間、蛋白毒性以及宿主自身代謝活動對表達(dá)結(jié)果的影響。當(dāng)候選蛋白數(shù)量從幾個(gè)增加到幾十甚至幾百個(gè)時(shí)，這些步驟就會迅速形成明顯的規(guī)?；款i。

CFPS則提供了一種不同的思路。它將蛋白質(zhì)合成所需要的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)器從細(xì)胞中釋放出來，在體外建立一個(gè)開放的蛋白合成環(huán)境。研究人員可以直接加入DNA模板，并根據(jù)目標(biāo)蛋白的特點(diǎn)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系中的溫度、輔因子、脂質(zhì)環(huán)境以及其他組分，從而把原本受到細(xì)胞生命活動約束的蛋白表達(dá)過程，轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)更加容易控制和并行化的生化反應(yīng)。

酶定向進(jìn)化本質(zhì)上是在巨大的序列空間中尋找具有更高活性、更好熱穩(wěn)定性、更強(qiáng)底物特異性或者更優(yōu)環(huán)境耐受性的蛋白變體。傳統(tǒng)方法需要經(jīng)歷突變文庫構(gòu)建、宿主轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)表達(dá)、樣品制備和酶活檢測等多個(gè)步驟，而CFPS可以將其中的表達(dá)環(huán)節(jié)壓縮到微量體外反應(yīng)中，使大量突變體能夠在相對一致的條件下快速獲得。

CFPS在酶工程中的價(jià)值已經(jīng)得到系統(tǒng)總結(jié)，其微量、并行的蛋白合成特點(diǎn)使研究人員能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量酶變體，并進(jìn)一步結(jié)合活性檢測開展生物催化劑篩選^[4]。

更進(jìn)一步，如果把CFPS與自動化液體處理以及熒光或吸光檢測結(jié)合起來，就可以建立一個(gè)典型的“突變體—表達(dá)—底物反應(yīng)—活性讀出"工作流。對于研究人員而言，真正需要關(guān)注的不再是“如何把384個(gè)蛋白分別表達(dá)出來"，而是如何設(shè)計(jì)一個(gè)可靠的功能檢測體系，讓384個(gè)蛋白能夠在同一實(shí)驗(yàn)邏輯下完成比較。

珀羅汀生物公開的應(yīng)用案例中，就包括基于CFPS進(jìn)行phi29 DNA聚合酶突變體表達(dá)和活性篩選，以及GFP定點(diǎn)飽和突變體的高通量篩選；其公開資料顯示，相關(guān)平臺已經(jīng)用于96個(gè)突變體的并行表達(dá)和功能檢測。

不同phi29 DNA聚合酶的突變體有不同的活性強(qiáng)度

傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)體系中，膜蛋白往往受到疏水性、膜定位、蛋白聚集以及細(xì)胞毒性等因素影響，因此表達(dá)條件優(yōu)化通常需要較長時(shí)間。CFPS由于沒有完整活細(xì)胞的生長和膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程，研究人員可以直接在反應(yīng)體系中引入去垢劑、脂質(zhì)體或者納米盤等膜模擬環(huán)境，并通過并行實(shí)驗(yàn)比較不同條件下的表達(dá)和溶解狀態(tài)。

這意味著一個(gè)原本需要反復(fù)試錯(cuò)的問題，可以被轉(zhuǎn)化為一個(gè)“條件矩陣篩選"問題：不同膜蛋白可以與不同濃度的去垢劑、不同脂質(zhì)環(huán)境以及不同反應(yīng)條件進(jìn)行組合，從而快速尋找更合適的表達(dá)條件。

這一思路已經(jīng)得到較為直接的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。Bruni等建立了高通量CFPS膜蛋白表達(dá)篩選流程，對61種真核膜蛋白分別在兩種去垢劑、兩種脂質(zhì)體和兩種納米盤體系中進(jìn)行表達(dá)測試，結(jié)果顯示，其中35種膜蛋白能夠在至少一種脂質(zhì)模擬體系中獲得可溶性表達(dá)產(chǎn)物，占全部測試對象的57%^[3]。

因此，未來更加理想的蛋白工程流程并不是“AI替代實(shí)驗(yàn)"，而是：

AI負(fù)責(zé)提出更值得實(shí)驗(yàn)的序列，CFPS負(fù)責(zé)快速驗(yàn)證這些序列，功能檢測負(fù)責(zé)產(chǎn)生真實(shí)數(shù)據(jù)，而這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)再反饋給AI模型。

這就是所謂的“Design-Build-Test-Learn"閉環(huán)。

2024年，Rapp等報(bào)道了SAMPLE（Self-driving Autonomous Machines for Protein Landscape Exploration）自主蛋白工程平臺，該系統(tǒng)利用智能算法學(xué)習(xí)蛋白序列—功能關(guān)系，并通過自動化機(jī)器人完成基因合成、蛋白表達(dá)和生化活性檢測，再將實(shí)驗(yàn)結(jié)果反饋給模型，用于下一輪蛋白設(shè)計(jì)[2]。這一研究展示了“計(jì)算設(shè)計(jì)—自動化實(shí)驗(yàn)—數(shù)據(jù)反饋"閉環(huán)在蛋白工程中的可行性，也為CFPS進(jìn)一步融入自動化蛋白研發(fā)平臺提供了重要參考。

從這一角度看，CFPS最重要的戰(zhàn)略價(jià)值其實(shí)并不是取代大腸桿菌、酵母或者CHO等成熟表達(dá)系統(tǒng)，而是成為這些體系之前的一層高速篩選和驗(yàn)證基礎(chǔ)設(shè)施。

未來可能出現(xiàn)的典型研發(fā)模式是：AI一次產(chǎn)生數(shù)千條候選序列，算法首先根據(jù)結(jié)構(gòu)和序列特征篩掉大部分低概率候選，再選擇幾十到幾百條序列進(jìn)入CFPS自動化表達(dá)，通過BLI/SPR、酶活、穩(wěn)定性或其他功能實(shí)驗(yàn)獲得真實(shí)數(shù)據(jù)，最后將這些數(shù)據(jù)重新輸入模型，進(jìn)行下一輪設(shè)計(jì)。

當(dāng)這個(gè)循環(huán)能夠在幾天甚至更短時(shí)間內(nèi)重復(fù)多輪時(shí)，蛋白工程的研發(fā)效率將不再主要取決于“一個(gè)蛋白需要多久才能表達(dá)出來"，而取決于一個(gè)研發(fā)團(tuán)隊(duì)一天能夠產(chǎn)生多少高質(zhì)量的序列—功能數(shù)據(jù)對。

蛋白質(zhì)工程正在進(jìn)入一個(gè)新的階段。AI讓研究人員能夠提出新的蛋白序列，自動化技術(shù)讓實(shí)驗(yàn)流程能夠并行處理越來越多的樣本，而真正決定這些設(shè)計(jì)能否走向應(yīng)用的，仍然是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

無細(xì)胞蛋白表達(dá)恰好位于這個(gè)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵位置。

它沒有必要取代傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)體系，也不意味著所有蛋白都應(yīng)該通過CFPS完成最終制備；它更現(xiàn)實(shí)、也更有價(jià)值的角色，是在蛋白研發(fā)早期承擔(dān)一個(gè)高速的“Build"和“Test"環(huán)節(jié)，讓大量候選序列能夠以更低的成本、更短的周期獲得真實(shí)的表達(dá)和功能數(shù)據(jù)。對于抗體發(fā)現(xiàn)、酶定向進(jìn)化、膜蛋白研究以及AI生成蛋白驗(yàn)證而言，這種能力正在變得越來越重要。

而當(dāng)CFPS與自動化、高通量功能檢測以及AI進(jìn)一步融合之后，蛋白工程正在從傳統(tǒng)的“設(shè)計(jì)一個(gè)、表達(dá)一個(gè)、驗(yàn)證一個(gè)"，逐步走向批量設(shè)計(jì)、批量表達(dá)、批量篩選和持續(xù)迭代。

這或許才是無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)在高通量篩選領(lǐng)域真正值得關(guān)注的未來。

[1] Thornton EL, et al. Applications of cell free protein synthesis in protein design. Protein Science. 2024;33(9):e5148.

[2] Rapp JT, Bremer BJ, Romero PA. Self-driving laboratories to autonomously navigate the protein fitness landscape. Nature Chemical Engineering. 2024;1:97–107.

[3] Bruni R, Laguerre A, Kaminska AM, McSweeney S, Hendrickson WA, Liu Q. High-throughput cell-free screening of eukaryotic membrane protein expression in lipidic mimetics. Protein Science. 2022;31(3):639–651. DOI: 10.1002/pro.4259.

[4] Application of Cell-Free Protein Synthesis for Faster Biocatalyst Development. Catalysts. 2019;9(2):190.