1. 依賴(lài)活細(xì)胞，周期冗長(zhǎng)：目標(biāo)基因需先克隆、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)，周期以"周"計(jì)，克隆與擴(kuò)增環(huán)節(jié)耗時(shí)費(fèi)力，難以滿(mǎn)足高通量需求。

2. 底物受限于細(xì)胞膜：基于細(xì)胞的篩選，只有能穿過(guò)細(xì)胞膜、進(jìn)入胞內(nèi)的底物才能與目標(biāo)酶相遇并被檢測(cè)，大量有價(jià)值的工業(yè)底物被天然排除在外。導(dǎo)致許多酶的真實(shí)底物譜被"裁剪"，篩選結(jié)果難以反映酶的真實(shí)性能。

3. 毒性蛋白與代謝干擾：對(duì)細(xì)胞有毒性的目標(biāo)酶無(wú)法在活細(xì)胞中表達(dá)；即便能表達(dá)，目標(biāo)酶的活性也不能干擾細(xì)胞正常代謝，篩選條件被迫限制在生理耐受范圍內(nèi)。

   
   

本文回顧了決定無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)能否"實(shí)用化"的能量供給問(wèn)題——從丙酮酸氧化酶介導(dǎo)的 ATP 再生，到直接利用葡萄糖糖酵解、甚至麥芽糊精和可溶性淀粉供能，這些進(jìn)展使無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的產(chǎn)量與成本得到了實(shí)質(zhì)性?xún)?yōu)化，讓其真正成為可規(guī)?；瘧?yīng)用的技術(shù)平臺(tái)。這些突破顯著提升了無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的產(chǎn)量與成本效益，并拓展了CFPS技術(shù)從高通量基因表達(dá)到大規(guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)的應(yīng)用范圍。

1.PCR 產(chǎn)物即模板

傳統(tǒng)流程中，模板 DNA 必須先克隆進(jìn)質(zhì)粒，而無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)可以直接"翻譯" PCR 擴(kuò)增的線(xiàn)性 DNA。針對(duì)線(xiàn)性 DNA 易被核酸酶降解的問(wèn)題，已有多種成熟對(duì)策，如：利用 λ 噬菌體 Gam 蛋白抑制 RecBCD 核酸外切酶、用改造菌株制備細(xì)胞提取物、為 mRNA 設(shè)計(jì)保護(hù)性莖環(huán)結(jié)構(gòu)等。這意味著，從菌落到蛋白表達(dá)，可以免去克隆步驟。

2.免克隆酶篩選

Kwon 等人成功應(yīng)用了不依賴(lài)克隆技術(shù)的無(wú)細(xì)胞表達(dá)策略，從多種微生物物種的推定基因中鑒定出新型酶類(lèi)。研究人員從微生物菌落中直接 PCR 擴(kuò)增 11 個(gè) ω-轉(zhuǎn)氨酶基因，在無(wú)細(xì)胞體系中表達(dá)后，針對(duì) 16 種氨基供體底物進(jìn)行活性篩選，僅數(shù)小時(shí)就鑒定出多個(gè)酶-底物匹配關(guān)系。

3.宏基因組挖掘

Clark 團(tuán)隊(duì)從牛瘤胃微生物組中篩選糖苷水解酶時(shí)，設(shè)計(jì)了一個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)：有活性的酶水解聚糖釋放單糖，單糖被體系代謝產(chǎn)生 ATP 繼續(xù)驅(qū)動(dòng)蛋白合成，同時(shí)酸性代謝物積累導(dǎo)致 pH 下降，通過(guò)檢測(cè) pH 變化來(lái)鑒定多種聚糖水解酶。在這一體系中可無(wú)縫銜接表達(dá)、篩選、信號(hào)讀出。

4.突變體文庫(kù)的高通量篩選

在定向進(jìn)化場(chǎng)景中，無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)同樣表現(xiàn)出色。SIMPLEX（單分子PCR聯(lián)用體外表達(dá)）技術(shù)將基因池稀釋至單分子水平，經(jīng)單分子 PCR 擴(kuò)增后在微孔板中進(jìn)行無(wú)細(xì)胞表達(dá)；此外，體外區(qū)室化（IVC）可將單個(gè)突變基因封裝進(jìn)油包水液滴，重建"基因型—表型"關(guān)聯(lián)，Swartz 團(tuán)隊(duì)將該技術(shù)成功應(yīng)用于[FeFe]氫化酶的定向進(jìn)化研究；Park 等人對(duì)南極假絲酵母脂肪酶 B（CalB）熱點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)化處理、轉(zhuǎn)化大腸桿菌分離變體后再進(jìn)行菌落 PCR，最后在微孔板中無(wú)細(xì)胞表達(dá)，數(shù)小時(shí)內(nèi)即完成突變體文庫(kù)的篩選。

5.非蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)的無(wú)細(xì)胞合成

細(xì)胞粗提物中的代謝酶并非簡(jiǎn)單的"雜質(zhì)"，它們也構(gòu)成了靜默的代謝途徑，這些途徑可針對(duì)特定目的重新激活。利用細(xì)胞提取物中所含的細(xì)胞酶構(gòu)建的合成途徑，可在表達(dá)需要輔基的復(fù)雜酶時(shí)用于合成非蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)。Kwon 等人在同一體系中同步合成血紅素輔基與脫輔基蛋白，直接獲得有活性的 P450 單氧酶。Bujara等人利用無(wú)細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)生產(chǎn)精細(xì)化工中間體——二羥基丙酮磷酸（DHAP）。Zhang 等人揭示了利用廉價(jià)碳水化合物在無(wú)細(xì)胞體系中制備氫氣及其他生物燃料的可行性。這些研究說(shuō)明CFPS技術(shù)為復(fù)雜酶（需要輔基的金屬酶、膜蛋白等）的篩選提供了全新可能。