隨著AI蛋白設(shè)計(jì)、抗體發(fā)現(xiàn)和酶定向進(jìn)化等技術(shù)的發(fā)展，研究人員能夠快速獲得大量候選蛋白序列，但如何在較短時(shí)間內(nèi)完成這些候選物的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，逐漸成為制約蛋白工程效率的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)蛋白表達(dá)流程通常需要經(jīng)歷基因構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白表達(dá)、純化以及后續(xù)功能檢測，當(dāng)候選序列數(shù)量從幾十個(gè)擴(kuò)展到數(shù)百甚至更多時(shí)，逐個(gè)表達(dá)和純化所帶來的時(shí)間、樣品和人工成本會(huì)進(jìn)一步放大。

無細(xì)胞蛋白合成（cell-free protein synthesis，CFPS）無需依賴完整細(xì)胞培養(yǎng)體系，能夠在較小反應(yīng)體系中快速完成蛋白表達(dá)，并可與96孔、384孔微孔板體系、自動(dòng)化液體處理以及BLI/SPR等功能檢測技術(shù)結(jié)合。因此，CFPS的價(jià)值正在從單純的“快速表達(dá)蛋白"，逐漸延伸至蛋白工程中的高通量預(yù)篩選和功能驗(yàn)證。^[1,4]

本文將圍繞高通量CFPS在蛋白篩選中的應(yīng)用展開，重點(diǎn)介紹其如何縮短“序列—表達(dá)—功能檢測"的實(shí)驗(yàn)鏈路，以及96孔、384孔體系和自動(dòng)化技術(shù)如何進(jìn)一步提升候選蛋白的并行驗(yàn)證能力。同時(shí)，文章將結(jié)合抗體、酶以及AI設(shè)計(jì)蛋白等應(yīng)用場景，討論為什么高通量篩選的核心并不僅僅是增加樣本數(shù)量，更重要的是獲得穩(wěn)定、可比較且能夠指導(dǎo)下一輪設(shè)計(jì)的功能數(shù)據(jù)。在這一技術(shù)發(fā)展趨勢下，蘇州珀羅汀生物也在圍繞CFPS、自動(dòng)化液體處理及BLI/SPR檢測進(jìn)行平臺(tái)化整合，為抗體、酶等蛋白的高通量表達(dá)與篩選提供技術(shù)支持。

在傳統(tǒng)流程中，研究人員往往需要先把候選蛋白表達(dá)出來，再進(jìn)行純化，最后才能進(jìn)入功能檢測；而CFPS最大的優(yōu)勢之一，在于表達(dá)和功能檢測之間的距離可以被大幅縮短。對(duì)于一些適合直接檢測的蛋白體系，研究人員甚至可以直接利用CFPS反應(yīng)液或簡單處理后的產(chǎn)物進(jìn)行功能分析，從而避免對(duì)每一個(gè)候選蛋白都進(jìn)行完整的表達(dá)放大和純化。^[1,2]

這一點(diǎn)對(duì)于高通量篩選尤其重要。

更值得注意的是，CFPS獲得的不僅是“表達(dá)了多少"的結(jié)果，還能夠幫助研究人員進(jìn)一步判斷一個(gè)蛋白設(shè)計(jì)為什么失敗：問題可能來自轉(zhuǎn)錄或翻譯效率，也可能來自蛋白溶解性不足，或者雖然能夠表達(dá)，卻沒有形成正確的結(jié)構(gòu)和功能^[1]。因此產(chǎn)生的數(shù)據(jù)不僅能夠用于“選出的蛋白"，還可以反饋給下一輪蛋白設(shè)計(jì)模型。

談到高通量篩選，人們很容易聯(lián)想到百萬級(jí)甚至化合物庫，但對(duì)于蛋白工程而言，真正具有產(chǎn)業(yè)價(jià)值的并不一定是盲目追求最大的數(shù)字。

對(duì)于AI生成蛋白、抗體突變體和酶定向進(jìn)化而言，一個(gè)非常常見的實(shí)際工作流是：算法首先生成數(shù)百到數(shù)千個(gè)候選序列，經(jīng)過計(jì)算評(píng)分后選擇其中幾十到幾百個(gè)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。這個(gè)階段的核心需求并不是一次篩選一億個(gè)分子，而是能夠在合理的時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定、準(zhǔn)確地比較幾百個(gè)蛋白。這正是96孔和384孔CFPS體系具價(jià)值的應(yīng)用場景。

在微孔板體系中，每一個(gè)孔都可以看作一個(gè)獨(dú)立的小型蛋白合成反應(yīng)器。不同DNA模板可以被自動(dòng)化液體工作站分別加入不同孔位，在相同條件下并行完成蛋白表達(dá)，隨后再通過ELISA、熒光檢測、酶活實(shí)驗(yàn)或者BLI/SPR等方法進(jìn)行功能分析。由于每個(gè)反應(yīng)所需的樣品量很低，整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系可以在較小體積下運(yùn)行，因此能夠顯著減少蛋白原料、耗材以及人工操作成本。^[1,4,6]

如果沒有自動(dòng)化，96孔和384孔依然需要大量人工移液，因此CFPS真正走向高通量應(yīng)用，還需要與自動(dòng)化液體處理、數(shù)據(jù)采集以及功能檢測平臺(tái)進(jìn)行深度結(jié)合。

這一點(diǎn)在產(chǎn)業(yè)實(shí)踐中已經(jīng)開始出現(xiàn)。

以蘇州珀羅汀生物目前公開的高通量CFPS平臺(tái)為例，其技術(shù)路線并不是單純提供無細(xì)胞蛋白表達(dá)，而是將CFPS與自動(dòng)化液體工作站以及BLI檢測體系進(jìn)行整合，使蛋白序列表達(dá)、功能檢測和結(jié)果分析盡可能進(jìn)入同一條自動(dòng)化流程。其公開資料顯示，該平臺(tái)面向抗體、酶等蛋白的高通量表達(dá)和篩選，并針對(duì)突變體篩選建立了從基因構(gòu)建、CFPS表達(dá)、功能檢測到候選物排名的數(shù)據(jù)流程。

這類平臺(tái)化思路的價(jià)值在于，它真正解決的是“實(shí)驗(yàn)流程之間的銜接問題"。如果只有CFPS而沒有自動(dòng)化，那么表達(dá)速度提升之后仍然可能被人工移液和樣品轉(zhuǎn)移拖慢；如果只有自動(dòng)化而缺少快速表達(dá)體系，那么自動(dòng)化工作站最終只是把傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)流程做得更機(jī)械化。因此，CFPS與自動(dòng)化之間并不是簡單疊加，而是相互放大效率。

對(duì)于需要進(jìn)行大量抗體或酶突變體驗(yàn)證的研究項(xiàng)目來說，這種能力意味著研究人員可以把更多精力放在候選序列設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)方案和數(shù)據(jù)分析上，而不是消耗在重復(fù)性的蛋白制備環(huán)節(jié)。

隨著噬菌體展示、酵母展示、單B細(xì)胞測序以及AI抗體設(shè)計(jì)的發(fā)展，研究人員越來越容易獲得大量潛在抗體序列，但從候選序列真正走到功能驗(yàn)證之間仍然存在一道實(shí)驗(yàn)鴻溝。尤其對(duì)于VHH、scFv、Fab以及全長IgG等不同形式的抗體分子，傳統(tǒng)表達(dá)體系在表達(dá)宿主、培養(yǎng)周期以及后續(xù)純化方面存在不同程度的限制。

CFPS提供了一種更適合前期篩選的路徑：研究人員可以將候選抗體序列直接轉(zhuǎn)化為DNA模板，在微量體系中并行表達(dá)，然后根據(jù)抗原結(jié)合能力進(jìn)行排序，最終只將表現(xiàn)的候選物推進(jìn)到規(guī)模化表達(dá)和進(jìn)一步的生物物理表征。

這種思路與BLI/SPR等無標(biāo)記結(jié)合分析技術(shù)具有天然的互補(bǔ)性。CFPS負(fù)責(zé)快速把“序列"變成“蛋白"，BLI或SPR則進(jìn)一步把蛋白轉(zhuǎn)化為結(jié)合動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，從而形成從基因到功能的連續(xù)數(shù)據(jù)鏈。

對(duì)于珀羅汀這樣的CFPS技術(shù)平臺(tái)而言，這種“表達(dá)+篩選"的組合也正是其高通量服務(wù)的重要應(yīng)用方向。公開資料顯示，其平臺(tái)針對(duì)VHH、scFv、Fab以及全長抗體等不同抗體形式進(jìn)行了體系適配，并將CFPS與自動(dòng)化移液和高通量BLI檢測結(jié)合，用于抗體候選物的快速表達(dá)和篩選。

如果不同孔之間存在明顯的反應(yīng)差異，或者表達(dá)量和功能信號(hào)之間無法建立穩(wěn)定關(guān)系，那么即使一天完成幾千個(gè)樣本，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)也未必真正具有研發(fā)價(jià)值。因此，一個(gè)成熟的CFPS高通量平臺(tái)需要同時(shí)解決表達(dá)一致性、功能檢測靈敏度、樣品歸一化、自動(dòng)化誤差控制以及數(shù)據(jù)分析等多個(gè)問題。^[1,3]

尤其需要強(qiáng)調(diào)的是，蛋白表達(dá)量并不等于功能性蛋白產(chǎn)量。一個(gè)突變體可能表達(dá)量很低，但單位蛋白活性卻非常高；如果篩選體系只按照總表達(dá)信號(hào)進(jìn)行排序，就可能把真正具有價(jià)值的候選物淘汰。因此，高通量CFPS平臺(tái)的設(shè)計(jì)重點(diǎn)應(yīng)該逐漸從“Protein yield"轉(zhuǎn)向“Functional protein yield"，即真正能夠產(chǎn)生目標(biāo)功能的蛋白產(chǎn)量。^[1,5]

這也是為什么功能檢測技術(shù)在CFPS高通量平臺(tái)中具有越來越重要的地位。只有把表達(dá)數(shù)據(jù)與酶活、結(jié)合能力、穩(wěn)定性等功能數(shù)據(jù)結(jié)合起來，才能真正回答蛋白工程最關(guān)心的問題：哪個(gè)序列值得繼續(xù)做？為什么它值得繼續(xù)做？

從這一點(diǎn)來看，CFPS、自動(dòng)化液體處理以及BLI/SPR等檢測技術(shù)之間的結(jié)合并不是簡單的設(shè)備堆疊，而是在共同構(gòu)建一條從DNA到功能數(shù)據(jù)的高速通道。珀羅汀生物目前公開的高通量技術(shù)路線，也正是圍繞這一思路，將自主CFPS體系、自動(dòng)化工作站以及高通量無標(biāo)記檢測進(jìn)行整合，形成從序列輸入到功能篩選的完整流程。

高通量CFPS的價(jià)值，并不只是一次表達(dá)更多蛋白，而是縮短“序列—表達(dá)—功能檢測—篩選"的迭代周期，讓更多候選蛋白能夠被快速驗(yàn)證。隨著CFPS、自動(dòng)化和BLI等技術(shù)進(jìn)一步融合，高通量蛋白篩選也將從“追求樣本數(shù)量"逐漸走向“獲得高質(zhì)量功能數(shù)據(jù)"。圍繞這一方向，蘇州珀羅汀生物也在持續(xù)推進(jìn)CFPS與自動(dòng)化高通量篩選技術(shù)的融合，為抗體、酶及其他蛋白工程項(xiàng)目提供快速表達(dá)與功能篩選支持。